如何科学客观评价替抗产品——论抑菌试验在饲用替抗产品评价中的局限性

饲用抗菌素作为一种畜禽促生长剂，促生长效果得到一致证实，自从1946年首次报道了链霉素可刺激雏鸡生长，1950年美国食品与药物管理局（FDA）首次批准抗菌素用作饲料添加剂后，抗菌素在饲料上的应用已有几十年的历史。随着饲用抗菌素即将禁止使用，如何去评价不同替抗产品与组合方案，成为现今不少饲料企业需要面对的问题，笔者认为以往在评价饲用抗菌素时常用的抑菌圈试验、MIC测定来评价饲用替抗产品并不科学客观，在这里提出一些见解与大家共同探讨。

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抑菌仅是饲用抗菌素促生长的

可能机制之一

饲用抗菌素促生长机制并未完全解析，抑菌只是其可能的作用机制之一，研究表明饲用抗菌素作用机制可能包括：抑菌、抗炎、改善肠道黏膜结构、降低亚临床感染、抑制先天性免疫等多条主要通路。

▷  1.1 抑菌作用

肠道微生物与宿主之间存在共生关系，倾向于与宿主竞争能量与蛋白质的吸收（Hedde等，1986），细菌利用葡萄糖产生乳酸降低了宿主对能量的利用（Saunders等，1982），小肠细菌利用葡萄糖使猪日粮净能损失6％（ Vervaeke等，1979）。抗菌素能通过对肠道菌群的直接作用，抑制肠道微生物的生长和活性，减少了微生物对能量和养分的吸收利用、节约养分，从而增加了宿主的可利用养分，促进动物生长。

▷  1.2 降低亚临床感染

抗菌素对动物消化道内的一些病原菌有抑制或杀灭作用，使动物抗病力间接增强，可降低动物的亚临床感染，起到一定预防和治疗疾病的作用，降低了发病率，从而达到保证动物健康和充分发挥生长潜能的作用。但需要注意的是，不同种类的抗菌素结构不同，并通过不同的机制产生抗菌效果，有抑制细菌胞壁合成的抗菌素，有损害细菌胞浆膜的抗生素，有抑制细菌蛋白合成的抗生素，也有抑制核酸（DNA）合成的抗生素，但对动物生长和饲养效率的改善作用都很相似，因此，抗菌素促生长机制显然独立于其抗菌方式（Lawrence，1998）。

▷  1.3 改变肠道形态结构

有研究表明，某些抗菌素可使动物的肠壁明显变薄，增加了膜的通透性，从而有利于肠壁对营养物质的渗透和吸收，提高饲料营养物质的吸收利用率。研究发现,无菌鸡的肠壁重量比常规鸡的要轻,而且前者的厚度也比后者的薄。Gor-don(1952)和Pepper(1953)研究发现,常规鸡使用抗生素后肠壁的重量会减轻、厚度会减少。姚浪群等（2003）研究发现在仔猪日粮中添加安普霉素可显著减轻小肠相对重量17．7％（ P＜0．05)、缩短小肠相对长度13．7％（P＜0．05)，并使小肠绒毛排列规则、高度增加（P＜0．05），绒毛高度／隐窝深度的比值增大，说明安普霉素对仔猪具有降低肠壁厚度、改善肠粘膜结构的作用，从而有利于营养物质的吸收。有推测抗菌素会抑制肠道内微生物产生的毒素和有害代谢产物,并减弱二者对肠壁细胞的刺激,从而使肠壁变薄，有利于营养物质的吸收,最终起到促生长作用。

▷ 1.4 抑制先天性免疫

不少研究表明，抗菌素能降低机体免疫应答水平，减少机体用于免疫反应的营养物质，节约养分，从而发挥促生长作用。Roura(1992)等在用青霉素、链霉素和土霉素研究抗菌素对肉仔鸡的促生长机制的试验中发现青霉素和链霉素可以明显降低血浆中白细胞介素-1的水平，同时观测到肉仔鸡的体增重和饲料转化率明显提高，并首次提出抗菌素的促生长作用可能与其抑制免疫反应有关。Abd等(1996)，用阿伏霉素和维吉尼亚霉素作为促生长剂，研究促生长作用与免疫系统的关系，结果发现两种抗生素可以明显提高肉仔鸡的生长速度，同时观测到处理组鸡的法氏囊重量显著降低，另外，血清中羊红细胞(SRBC)特异性抗体，球蛋白浓度都显著降低，再次说明饲用抗菌素的促生长作用与其抑制免疫反应有关。佟建明(2001)研究发现金霉素对肉仔鸡的体液免疫和细胞免疫都产生明显的抑制作用，同时还发现随肉仔鸡免疫水平的降低，日采食量和生长速度显著增加，金霉素的促生长作用与其降低免疫反应水平有关。

▷ 1.5 抗炎作用

上面有提到，种类繁多的不同类型饲用抗菌素都具有相似的促生长效果，可以看出饲用抗菌素应该有独立于其抗菌作用的另外一条促生长通路，现在的研究来看，这条通路应该就是抗炎作用。对抗菌素促生长机理再认知发现：饲用抗菌素能抑制细菌增殖，减轻炎症反应程度，减少和减轻疾病表现；而病原菌本身就是致炎因子之一；抗菌素能在炎症细胞中积累，抑制炎症细胞功能（T.A.Niewold，2007）；饲料中添加的抗菌素，一般都大大低于MIC（最低抑菌浓度），主要通过抗炎（细菌引起）发挥作用；饲用抗菌素抑制了先天性免疫反应，这种相关的生理效应下调炎症反应。对一些抗菌素与促生长效果进行比对发现，饲用抗菌素的抗炎作用与其促生长效果具有高度一致性，具有抗炎活性的抗菌素才有可能成为饲用促生长抗菌素，反之则无促生长作用（如下图）。另外，也发现如：乙酰水杨酸、SCFA（短链脂肪酸）、多酚等一些具有抗炎活性的物质也具有类似AGPs（饲用促生长抗菌素）促生长效果，这些都说明，抗炎作用应该就是AGPs促生长非常重要的作用机制。

除上之外，饲用抗菌素还有一些其它可能促生长作用机制，如：可延长消化吸收时间，用土霉素发酵残渣饲喂仔猪（2～3月龄），可使试验猪的食物在肠道中的滞留时间延长，更多的营养成分被吸收利用；刺激生长激素分泌，能刺激脑下垂体，使其分泌促生长激素的量增加，从而促进了动物的生长，Hathaway等（1996）报道，仔猪饲喂抗菌素ASP－250（金霉素、磺胺二甲基嘧啶、青霉素）后，血清中的胰岛素样生长因子（IGF－1）含量增多。

总而言之，目前饲用促生长抗菌素作用机制并不清晰明确，抑菌只是其可能的作用机制之一，而且现在来看，抗炎作用对于饲用促生长抗菌素发挥促生长效果的意义更大。

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抑菌圈试验、MIC测定的原理方法

与局限性

▷ 2.1 抑菌圈试验、MIC测定的原理方法

抑菌圈实验与MIC（最低抑菌浓度）的测定是抗菌药物研发和筛选早期应用比较成熟的体外实验方法。MIC是测量抗菌药物的抗菌活性大小的一个指标，指在体外培养细菌18至24小时后能抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度。抑菌圈和抑菌物质浓度的对数是成正比的，也就是抑菌物质浓度越高，抑菌圈越大，抑菌物质浓度一直稀释下去，则抑菌圈的直径逐渐变小，直到没有抑菌圈出现，这个临界浓度就是MIC。通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，和评价比较不同药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。主要方法有进行定性测定的扩散法（如：抑菌圈试验）和进行定量测定的稀释法（如：最低抑菌浓度试验）。

定性测定的扩散法进行抑菌圈实验研究中，使用最多的主要有K-B法（纸片扩散法）、牛津杯法和打孔法三种。K-B法，选用质地均匀的滤纸，用打孔机打成直径相同的圆片，灭菌后烘干，浸泡于待测样品中，然后置于试验平板中培养一段时间后测定抑菌圈大小的一种方法。牛津杯法又称杯碟法，将已灭菌的牛津杯置于试验平板中，往杯中注入一定量的待测样品，培养一段时间后测定抑菌圈大小的一种方法。打孔法，是指用已灭菌的打孔器或钢管在试验平板上打孔，往孔中注入一定量的待测样品，培养一段时间后测定抑菌圈大小的一种方法。通过抑菌试验研究可以对不同抗菌药物的体外抗菌活性进行初步的定性比较研究。

稀释法试验用于定量测试抗菌药物对某一细菌的体外活性，可以对最小抑菌浓度进行测定，分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。实验时，抗菌药物的浓度通常经过倍比（lg2）稀释，能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最低抑菌浓度（MIC），一个特定抗菌药物的测试浓度范围应该包含能够检测细菌的解释性折点（敏感、中介和耐药）的浓度，同时也应该包含质控参考菌株的MIC。通过稀释法试验可以对不同抗菌药物的MIC进行测定，对抗菌药物的体外抗菌活性进行初步的定量比较研究。

▷ 2.2 抑菌试验的局限性

可以看出无论是抑菌圈试验，还是MIC的测定，都是在体外培养基中进行的，影响因素：培养基的质量、抗菌药物、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌试验方法精度和质控菌株本身的药敏特性等众多试验因素均能影响试验结果的准确性。同时最大的不足在于，前面所有的抑菌试验都是在体外进行，而当产品实际应用于生产过程中时，面对的是体内复杂的生理环境，体内胃肠道内环境，无论是pH值，缓冲体液系统、各种消化酶、食糜物质等都是完全不同于体外培养基环境，并且体外抑菌试验为明确的单一或少数几种参考菌株，而动物含有复杂多样的肠道微生态环境。体外抑菌试验一般为pH值7.2-7.4，而体内胃肠道pH值一般为胃液0.9-1.5，胰液7.8-8.4,胆汁8.0-9.4，小肠液8.2-8.7,变化幅度很大，同时消化道内消化酶、以及微生物数量约为动物组成细胞的10倍，具有多样性（下图）。

所以体外抑菌试验的结果必然与动物体内的实际使用效果存在一定差异，仅仅只能用于对抗菌药物进行体外初步筛选。

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 常见替抗产品对动物的影响与

综合评价替抗产品

▷ 3.1 常见替抗产品对动物的多方面影响

市面上常见的几类替抗产品，对动物的作用与影响是多方面的，从肠道微生物、肠道形态、免疫水平、氧化指标、抗炎、改善消化率等多方面对动物机体发挥作用，最终结果体现在动物生长性能改善上，而绝不仅仅是通过抑菌来发挥作用。

（1）植物精油

植物精油能抑制有害菌，提高抗氧化能力，具有一定的抗炎、提高免疫力作用，发挥促生长作用。张文静(2017)对复合植物精油，方剂为丁香酚、百里香酚、香芹酚，研究表明，对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌都有一定的抑杀作用，可以增加肉鸡的免疫功能，同时通过抑制 TLR4/NF-κB 通路，抑制炎性细胞因子分泌等方面，可以提高肉仔鸡生长性能和抗病力。Hashemipour 等研究中表明，由百里香酚和香芹酚组成的复合精油增加动物机体抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，MDA含量显示降低，在动物生长性能方面表现有一定的提高。方热军等研究表明日粮中添加植物精油饲喂断奶仔猪后，显著提高谷胱甘肽过氧化物酶与超氧化物歧化酶的活力，同时生长性能表现出改善。

（2）酸化剂

酸化剂可以提高肠道消化吸收功能，改善肠粘膜层，调节肠道微生物，促进动物生长。Ｙｏｕｓａｆ 等研究表明，添加包被苯甲酸可以调节肉鸡盲肠微生物菌群，增强乳酸杆菌的繁殖。Li等(2008)研究发现,有机酸具有提高肠道食糜中乳酸杆菌数量,降低大肠杆菌数量的作用。刁慧等(2013)在断奶仔猪饲粮补充5000mg/kg苯甲酸,显著提高了肠道内二糖酶活性,提高了养分消化率,从而达到改善仔猪生长性能的作用。Ｇｉａｎｎｅｎａｓ 等报道，添加苯甲酸能显著提高肉鸡空肠绒毛高度。Oh等(2012)研究表明，断奶仔猪饲粮中添加5000mg/kg苯甲酸能够显著降低仔猪肠道IL-1、IL-6和TNF-αmRNA表达量,降低肠道炎症反应,改善肠道屏障功能。

（3）微生态制剂

益生菌能有效地改善肠道菌群,提高养分消化率,以及增强机体免疫应答,从而提高动物生长性能。Fuentes等(2008)给断奶仔猪饲喂乳酸杆菌可有效改善肠道微生物菌群多样性,提高肠道食糜乳酸杆菌数量以及降低大肠杆菌数量,改善肠道健康。周盟等(2013)研究显示,仔猪饲粮中加入植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌复合菌可显著增加营养物质的表观消化率,从而改善仔猪生长性能。Rutherfurd等(2004)研究发现鼠李糖乳杆菌可以增强巨噬细胞的吞噬活性；赵强等（2019）研究结果表明，日粮中添加丁酸梭菌能够促进蛋白质代谢，减少脂肪沉积，改善肉鸡屠宰性能与生长性能。

（4）中兽药--博落回散

作为时下研究比较热门的替抗资源产品中兽药博落回散，同样也从多方面发挥着替抗促生长作用：

降低有害菌水平:

改善肠道形态结构：

降低氧化应激水平：

改善免疫系统发育水平：

提高养分消化利用率：

明确的抗炎机制与很强的抗炎活性：

博落回散提取物血根碱具有很强的抗炎活性，是一个强有效的核因子－κB( NF-κB) 的抑制剂，可以在体内外有效地抑制炎症介质的表达和全身性炎症的发生。

博落回散在提高动物生产性能方面，具有饲用抗菌素相当的效果。由湖南美可达生物公司与湖南农业大学研究团队共同研究开发的博落回散（美佑状），科学客观的来说博落回抗菌效果显著。

▷ 3.2 综合评价替抗产品

前面提到，AGPs的促生长机制具有多条可能通路，对肠道内微生物的影响（抗菌活性）仅仅是其中一条通路，其它通路同样发挥了重要作用。上面提到的大量研究表明，市面上常见的替抗产品，同样从多方面对动物发挥着作用影响，最终起到促生长作用，改善动物生产性能。因而应从多方面对替抗产品进行综合评价，如：肠道微生物、肠道形态结构、氧化水平、免疫水平、炎性因子、尤其最终的生长性能指标等。

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总结

总而言之，饲用抗菌素促生长机制并未完全解析，抑菌只是其可能的作用机制之一，抑菌圈实验以及MIC测定作为应用广泛的评价抗菌药物的试验方法，仅适用于抗菌药物的早期研发筛选。而在评价相应替抗产品时，作为体外试验的抑菌结果与动物体内的使用效果是具有差异性的，仅具有一定的早期参考价值，而且仅对抑菌一方面进行考量，具有局限性。饲用抗菌素以及替抗产品发挥促生长作用具有多条通路，对于替抗产品添加应用于饲料配方中的评价，应该从多方面，如：对肠道微生物、肠道形态结构、动物机体免疫系统的影响，抗氧化能力，抗炎活性等多方面，尤其应以实际生产中对动物生产性能的改善效果为主要依据进行全面综合评价，才能科学客观反应相应替抗产品与组合方案的替抗效果。