血根碱对LPS诱导后黄鳝免疫应激及肠道炎症相关基因表达的影响
发布时间：
2021-01-27
来源：
文献来源：石勇，胡毅，刘艳莉，车常宝，钟蕾
血根碱对LPS诱导后黄鳝免疫应激及肠道炎症相关基因表达的影响．中国水产科学，2019.
文章整理：陈旭
随着我国水产养殖规模的逐步扩大和集约化程度的不断提高，以及饲料原料的不合理使用，导致机体免疫力降低和肠道损伤。而抗生素因具有提高免疫力和抗炎等作用被用于水产动物疾病防控，但因其滥用导致耐药性、药物残留及水环境污染等问题被限用和禁用。近年来，关于中草药及天然植物提取物提高水产动物生长、增强免疫力及抗炎等作用已有相关报道。
血根碱是一种苯并菲啶异喹啉类生物碱，主要存在于博落回、白屈菜和血水草中，其化学活性基于其亚胺基团的亲核性，具有极强抗炎活性，通过抑制NF-κΒ炎症信号通路的激活，从而抑制促炎细胞因子的表达，发挥抗炎作用；还可提高抗氧化酶系活性，参与氧化剂清除，发挥抗氧化应激能力。血根碱是湖南美可达生物资源有限公司与湖南农业大学中兽药湖南省重点实验室共同开发的博落回提取物中的核心活性成分，现已开发注册为我国首个二类新中兽药博落回散（商品名：美佑壮）。
脂多糖(LPS)是一种革兰氏阴性菌抗原，是常见的内毒素，也是常见的致炎因子，当其与细胞膜上相应受体作用后，启动胞内信号传递链，引起核转录因子-κB(NF-κB)等活化，启动基因转录、表达和释放多种细胞因子，诱导促炎基因的转录从而引发炎症反应。本研究以黄鳝为研究对象，通过探讨血根碱是否具有缓解由脂多糖(LPS)诱导后黄鳝免疫应激及肠道炎症反应的作用，旨在为血根碱在水产饲料中的应用提供科学依据。
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试验方法
本实验设置对照组(基础饲料)和实验组(基础饲料+750μg/kg血根碱)，挑选初始体重为(28.00±0.03)g的黄鳝随机分成2组，即对照组与实验组，每组3个重复，共6个网箱(1.5m×2.0m×1.0 m)，每个网箱饲养50尾黄鳝，养殖实验持续8周，结束后，禁食24 h，每重复随机取30 尾规格一致的黄鳝进行腹腔注射10mg/kg 大肠杆菌脂多糖(LPS)，在注射前0h和注射后3h、6h、12h、24h和48h进行尾静脉采血、取鱼体肝脏、取鱼体肠道组织等采样工作，每重复每个时间节点采集5尾。
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结果与分析
2.1 血根碱对脂多糖诱导后对黄鳝血清葡萄糖和皮质醇的影响
在0h时，对照组和实验组血清中葡萄糖（GLU）和皮质醇（COR）的含量无显著差异(P>0.05)；注射LPS后，对照组中GLU和COR的含量随时间呈先上升后下降的趋势，在3h和6h显著升高(P<0.05)；与对照组相比，实验组变化趋势与其一致，但GLU和COR 的含量上升幅度小，并且恢复至正常水平速度更快，在6h时GLU显著低于对照组(P<0.05)。
注：小写字母与大写字母分别表示对照组和实验组分别在注射LPS 后不同时间的差异显著性(P<0.05)；图中*表示对照组与实验组在同时间节点的差异显著性(P<0.05)（下同）。
2.2 血根碱对脂多糖诱导后对黄鳝血清免疫指标的影响
在0h时，与对照组相比，实验组血清中免疫球蛋白M（IgM）、补体3（C3）和补体4（C4） 的含量升高，且C4显著升高(P<0.05)；注射LPS 后，对照组血清中碱性磷酸酶（AKP）、IgM 和C4的含量随时间呈先上升后下降的趋势(P<0.05)，在3～6 h 达到峰值，且在12h之后恢复至注射前水平，而C3含量呈一直上升的趋势；与对照组相比，实验组变化趋势与其一致，但在添加血根碱AKP、IgM和C4的上升幅度更大，且在3h时，C4显著高于对照组(P<0.05)，以及实验组恢复至正常水平所需时间更短，并且C4和IgM含量分别在6～24h和12h时显著低于对照组(P<0.05)。
2.3 血根碱对脂多糖诱导后黄鳝肝脏抗氧化指标的影响
在0h时，实验组黄鳝肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）含量显著高于对照组(P<0.05)，丙二醛（MDA）含量与其相反；注射LPS后，对照组肝脏中过氧化氢酶（CAT）和MDA活性没有显著影响(P>0.05)，SOD活性随时间呈先升高后降低的趋势，在3h时达到峰值；投喂血根碱组与对照组变化趋势一致，与对照组相比，实验组在3h、24h和48h时SOD 活性显著升高(P<0.05)，在48h时MDA活性显著降低(P<0.05)。
2.4 血根碱对脂多糖诱导后黄鳝肝脏损伤指标的影响
在0h时，对照组与实验组血清中谷草转氨酶（GOT）和谷丙转氨酶（GPT）含量没有显著性差异(P>0.05)；注射LPS后，血清中GOT和GPT含量随时间呈先升高后降低的趋势(P<0.05)，在3h达到峰值，在24h恢复到0h水平；实验组与对照组变化趋势一致，但所需恢复时间短，并且GOT和GPT含量分别在6h、12h、48h和6h、48 h显著低于对照组(P<0.05)。
2.5 血根碱对脂多糖诱导后黄鳝肠道免疫相关基因表达的影响
2.5.1 肠道IL-1β、IL-10、IL-12β和IL-15基因相对表达量
在0h时，实验组黄鳝肠道白介素（IL）-10和IL-15基因相对表达量显著高于对照组(P<0.05)，IL-1β基因相对表达量与其相反；注射LPS后，肠道IL-1β、IL-10、IL-12β和IL-15基因相对表达量随时间呈先上升后下降的趋势，IL-1β和IL-12β基因相对表达量在3h和6h显著升高(P<0.05)，IL-10基因相对表达量在3h、6h和12h显著升高(P<0.05)；实验组与对照组变化趋势一致，但IL-1β和IL-12β基因相对表达量在3h、6h、12h和24h时显著低于对照组(P<0.05)，以及IL-10和IL-15基因相对表达量上升速度高于对照组，且IL-10基因相对表达量在6h、12h和24h时显著高于对照组(P<0.05)。
2.5.2 肠道TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3基因相对表达量
在0h时，实验组肠道中生长转化因子（TGF）-β1和TGF-β3基因相对表达量显著高于对照组(P<0.05)；腹腔注射LPS后，对照组TGF-β1和TGF-β2基因相对表达量随时间呈先上升后下降再上升的趋势，TGF-β1和TGF-β2基因相对表达量分别在3h和6h时显著升高(P<0.05)；实验组与对照组变化趋势一致，但TGF-β1和TGF-β3基因相对表达量在注射LPS后一直高于对照组，且在3h、12h和24h时TGF-β1显著高于对照组(P<0.05)。
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结论
（1）血根碱能缓解应激反应
GLU和COR是鱼类应激的灵敏信号，会随着应激程度的不同而发生改变。当机体受到应激时，需要消耗更多的能量来缓解所引起的不适，会引起血清中COR和GLU含量上升。实验组的GLU和COR含量在3h时低于对照组，并且恢复至正常水平速度更快，这说明血根碱能够缓解黄鳝由LPS 诱导的免疫应激反应，并且缩短机体对LPS应激的适应时间。
（2）血根碱能提高免疫能力
鱼类不具有健全的免疫机制，主要依靠非特异性免疫系统来应对环境刺激和病原入侵。其中补体系统是抵抗微生物感染的重要成分，是先天性和适应性免疫的交汇点，包括经典途径、凝集素途径和旁路途径三条激活途径，C3和C4是其重要成分。AKP是机体内重要的解毒物质，是动物溶酶体重要的组成部分，在机体非特异性免疫反应中发挥着重要作用。此外，IgM 是鱼类最主要的免疫球蛋白，是当机体收到抗原刺激后最先产生的抗体，具有很强的细胞毒活性和细胞溶解活性。实验组在注射前黄鳝血清中IgM、C3和C4的含量都高于对照组，并且在注射LPS后，实验组的AKP、IgM和C4的含量上升幅度高于对照组，表明血根碱能够促使机体相关免疫指标在受到LPS应激后快速上升，进而有效降低LPS对鱼体的毒性，并且相关免疫指标恢复至正常水平更快，这些说明血根碱能够提高黄鳝的免疫能力以及在LPS 诱导后产生免疫应激反应中发挥抑制作用，增强抵抗能力，以维持机体免疫平衡。
（3）血根碱可提高抗氧化能力
SOD和CAT是鱼体重要的抗氧化指标，在氧化与抗氧化平衡转化中起关键作用，SOD能够将超氧阴离子自由基转化成氧气和过氧化氢，CAT则能够将过氧化氢分解成氧气和水，从而减轻细胞受损。而MDA是自由基引发脂质过氧化反应后的最终分解产物，由羟基阴离子攻击细胞膜所产生，具有很强的生物毒性，并且会破坏细胞的结构和功能。本实验中，添加血根碱在注射前提高了黄鳝肝脏中SOD和CAT的活性，降低了肝脏中MDA含量，并在LPS应激后可使肝脏中SOD活性提高，在一定程度上降低了MDA产生，表明血根碱可提高黄鳝肝脏中抗氧化能力，并抑制LPS 诱导的免疫应激反应，以维持机体平衡。
（4）血根碱可降低肝损伤
血清中能反映机体肝脏损伤情况的两个代表性指标是GOT和GPT，当肝脏受损或通透性改变后，血清中GOT和GPT的活性就会升高。本实验结果表明，对照组黄鳝在腹腔注射LPS 之后，血清中GOT和GPT急剧上升，这可能是因为腹腔注射LPS后造成肝脏急性损伤。实验组比对照组恢复至正常水平速度更快，这说明血根碱能够有效地抑制LPS诱导后而产生的机体急剧肝损伤。
（5）血根碱可降低炎症因子表达，降低炎症反应，降低肠炎发生
IL-1β在免疫应答中发挥重要作用，是最重要、最快的炎症介质之一，IL-12是促炎细胞因子和前列腺细胞因子，IL-10具有抗炎特性，减少促炎介质的产生，抑制抗原呈递，IL-15具有维持T细胞记忆的能力和具有自然灭活T细胞生长因子的功能。本实验中，注射LPS 后，黄鳝肠道中IL-1β和IL-12β相对表达量在3～6h显著上升，但与对照组相比，实验组可以显著降低由LPS 刺激后引起的IL-1β和IL-12βmRNA表达量上升，并且使机体快速恢复至正常水平；在0h时，添加血根碱组黄鳝肠道中IL-10和IL-15的基因表达量高于对照组，并且在LPS 刺激后其表达量上升并显著高于对照组，这表明血根碱能够降低LPS刺激黄鳝后而产生的炎症反应，并且有效抑制炎症介质的表达。
TGF-β作为一种免疫调节细胞因子，其中包括三个亚型TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，三者功能类似，可下调其他细胞因子的表达和细胞因子诱导的作用，在维持免疫平衡和重建免疫稳态中发挥重要作用。本实验中，与对照组相比，实验组可促进LPS 刺激后肠道中TGF-β1和TGF-β3的基因表达。说明血根碱可提升LPS刺激黄鳝后TGF-β水平，进而抑制体内促炎因子，抑制炎症反应。
总而言之，在本实验条件下，腹腔注射LPS能够诱导黄鳝产生免疫应激反应，在3～6 h时出现高峰，并在6h之后相继恢复至正常水平；饲料中添加血根碱能够有效改善黄鳝由LPS诱导的血清免疫、肝脏抗氧化指标及肠道炎症相关基因的变化，进而有效抑制LPS 诱导而产生免疫应激及肠道炎症反应。
血根碱,博落回,白屈菜,湖南美可达,新中兽药博落回散,美佑壮
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